第五章-4 高等植物基因工程-10.txt

四、高等植物基因工程高等植物的遗传学特征高等植物基因工程的基本概念高等植物的基因转移系统高等植物的基因表达系统（一）高等植物的遗传学特征植物的基本特征遗传操作的简易性整株植物的再生性染色体的多倍体性1、植物的基本特征植物低等植物高等植物含根、茎、叶、花、果分化器官合子经胚再发育为个体苔藓门、蕨类门、裸子门、被子门无根、茎、叶等分化器官合子不经胚直接发育为个体藻类、地衣2、遗传操作的简易性多数高等植物有自我授精的遗传特征，能产生大量的后代；借助于如风、重力、昆虫传播等自然条件，授精范围广、速度快、效率高，即便是频率极低的基因突变和重组事件，其遗传后果也易被观察。3、整株植物的再生性将一小片鲜嫩的愈伤组织置于含合适营养和植物生长激素的组织培养基中，细胞会持续生长并分裂。将这些细胞涂在特定固体培养基上，会长出新的幼芽，并重新分化成叶、根、茎，最终成为整株开花植物。愈伤组织：植物损伤后，在伤口长出的软组织。生长素/分裂素的比例高，则根部发育；比例低，则茎部发育。愈伤组织的细胞分化取决于植物生长素(auxins)和分裂素(cytokinins)的相对浓度。大多数单子叶农作物（如谷类作物）很难从原生质再生出完整细胞。植物细胞具有纤维素构成的细胞壁，通常不能有效吸收外源DNA。用纤维素酶处理植物细胞壁，形成原生质体，吸收DNA分子后，经过再生、愈伤组织形成，培育出整株植物。4、染色体的多倍体性多倍体植物在组织培养过程中呈现较高的遗传不稳定性，导致体细胞变异。大约2/3的禾本科植物呈多倍体型，染色体数目24-144。很多高等植物拥有比人类更大的基因组，并以多倍体形式存在。（二）高等植物基因工程的基本概念高等植物基因工程高等植物细胞基因表达技术高等植物转基因技术转基因植株改良农作物遗传性状植物工程细胞大规模生产蛋白多肽药物高等植物基因工程的发展历程1983：美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜；1994：世界上第一种耐储藏番茄在美国批准上市；1995：转基因抗虫、抗除草剂玉米和棉花在美国投入生产；2000：美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆。转基因技术虽然只有27年的历史，但所涉及的作物种类甚多。包括：水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄。至2009年底，全球已有25个国家批准了24种转基因作物的商业化种植，种植面积由1996年的170万公顷发展至1.34亿公顷，14年间增长79倍。最常见的转基因作物是转基因大豆、棉花、玉米、油菜，其中转基因大豆占全球大豆种植总面积的72%，转基因棉花占全球棉花种植总面积的47%。（三）高等植物的基因转移系统根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法植物病毒介导的转染植物细胞的直接转化植物原生质体的再生植物基因工程中的选择标记和报告基因根癌农杆菌(A.tumefaciens)是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，能在自然条件下特异性感染几乎所有双子叶植物（尤其豆科类植物）的根部和受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。1、根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法根癌农杆菌的这种致瘤特性是由其内的野生型Ti(Tumor-inducing)质粒介导的。根癌农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，将T-DNA插入植物基因组中，随其复制而复制。编码合成冠瘿碱(opine)的酶系。Ti质粒的结构：T-DNAtmstmrtmtopine代谢区Vir区TiplasmidoriT-DNAleftborderrightborder编码合成植物生长素(auxin)的酶系；编码合成细胞分裂素(cytokinin)的酶系；T-DNA：12-24kbtms：tmr：tmt：160-240kb植物生长素、细胞分裂素：促使植物创伤组织无限制生长与分裂，形成冠瘿瘤。冠瘿碱：代谢物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长必需的物质。：合成植物生长素、细胞分裂素；Ti质粒的功能区：致瘤区冠瘿碱合成区冠瘿碱代谢区毒性区(Vir区)：参与冠瘿碱合成；：参与冠瘿碱分解；：参与T-DNA转移、插入植物染色体。T-DNAtmstmrtmtopine代谢区Vir区TiplasmidoriT-DNAleftborderrightborder乙酰丁香酸植物根部羟基乙酰丁香酸COOHCH2OHCH3OCH3H3COCOOHOCH3H3CO损伤的植物根部分泌乙酰丁香酸、羟基乙酰丁香酸，诱导Ti质粒上的vir基因、农杆菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，操纵子表达产物与单链T-DNA结合成复合物，后者转化植物根部细胞。T-DNA单链根癌农杆菌Ti质粒Ti质粒Vir产物Ti质粒致瘤的分子机制LBRBOpineVirTi质粒T-DNAT-DNALBRB特异性核酸内切酶乙酰丁香酸、羟基乙酰丁香酸诱导表达在LB和RB的第3、4个碱基之间切开单链T-DNA整合于植物基因组上Ti质粒的改造原因：大量的生长素和分裂素会抑制细胞再生为整株植物。原因：冠瘿碱的合成大量消耗精氨酸、谷氨酸，影响植物细胞的生长。1）除去T-DNA上的生长素和分裂素生物合成基因(tms和tmr)。2）除去T-DNA上的冠瘿碱生物合成基因(tmt)。4）安装E.coli复制子，使其能在E.coli中复制，以利于克隆操作。3）除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体长度。5）安装植物细胞筛选标记（如新霉素抗性基因neor）、植物基因启动子、polyA化信号序列。6）安装MCS，以利于外源基因的克隆。共整合转化程序E.coli质粒上的重组T-DNA和根癌农杆菌中的野生型T-DNA之间的同源重组率不高，导致转化效率较低。大肠杆菌质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记多克隆位点重组质粒转化大肠杆菌农杆菌细菌接合T-DNA区同源整合农杆菌感染植物根部细胞T-DNA区整合在植物细胞基因组上重组LBRBT-DNA外源基因植物细胞筛选标记Kmr大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记农杆菌ori大肠杆菌ori将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区；转化携带Ti辅助质粒(只含vir区、不含T-DNA区)的农杆菌；重组农杆菌感染植物细胞。二元整合转化程序重组农杆菌转化植物的方法：叶盘法：共培养法：用重组农杆菌感染叶片外植体并短期共培养，不需进行原生质体操作。把重组农杆菌、植物原生质体共培养。芽在生根培养基上生根感染叶盘在选择培养基上长出愈伤组织和芽叶片消毒、切割叶盘与重组农杆菌共培养叶盘法的程序脱菌移植再生植株外源基因在整合入植物基因组中后，不发生修饰改变（如基因重排）。构建的转基因植株再生效率高；农杆菌介导的Ti质粒转化法的优点：成本低，转化率高；转入的外源基因拷贝数低，大多数为单拷贝。农杆菌介导的Ti质粒转化法的缺点：宿主局限性，主要用于双子叶植物的遗传转化。农杆菌极少能感染单子叶植物，一些重要的农作物（如水稻、小麦、玉米等）对其不敏感。根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法是目前转基因植物最常用的方法，80%的转基因植物是采用该方法获得的。植物病毒广泛存在，且不受单子叶或双子叶的限制，因此以病毒作为植物基因工程载体日益受到重视。在300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒占91%，双链RNA病毒、双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。2、植物病毒介导的转染RNA操作困难，不适合作为克隆载体。花椰菜花叶病毒(CaMV)：双链DNA病毒双生病毒(Geminivirus)：单链DNA病毒两种常用的植物病毒载体：转染植物细胞原生质体利用植物病毒载体转化植物细胞的战略：转染植物组织以双链DNA病毒花椰菜花叶病毒(CaMV)基因组为载体，去除有关的致病基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，由此再生成整株植物。1）转染植物细胞原生质体1）即使切除基因组中的非必需序列，其承载外源基因的能力还是有限，只能插入很小的片段。花椰菜花叶病毒载体：2）宿主范围非常窄，主要是芸苔属植物，如芜菁、甘蓝、花椰菜等。2）转染植物组织A链能单独在植物细胞中复制，含一部分病毒包衣蛋白基因；B链含另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方能形成有感染力的病毒。植物双生病毒(Geminiviruses)为单链DNA病毒，成熟病毒呈双颗粒状，每个颗粒中含一条不同的DNA单链。转染植物组织双生病毒家族成员--番茄金色花叶病毒(TGMV)表达载体的构建程序TGMVA链TGMVdsDNA体外复制用目的基因和标记基因取代病毒包衣基因克隆穿梭质粒农杆菌筛选标记大肠杆菌筛选标记转化携带辅助质粒的农杆菌染色体上已整合了病毒B链基因的植物茎组织注射重组病毒感染其他植物组织并表达目的基因2）可引起破坏性侵染，需严格防护，防止载体从宿主中逃逸，侵染自然中的植物。双生病毒载体：1）宿主范围广，是一种很有潜力的植物病毒载体，可侵染重要的作物（如玉米、小麦）。3、植物细胞的直接转化程序基因枪转化法电穿孔转化法激光微束穿孔法多聚物介导法花粉管通道法基因枪转化法快速简便，不受宿主范围限制，而受体植物细胞不需去除细胞壁，被转化的细胞或组织容易再生成植株；但成本高，转化率低。所有涉及植物原生质体的转化方法（农杆菌介导法、植物病毒转化法、电穿孔法、多聚物介导法）均存在一个难题：原生质体很难再生出整株植物。4、植物原生质体的再生原生质体的再生效率在植物转基因技术中至关重要。植物原生质体的再生程序1）将植物嫩叶、幼芽或愈伤组织切成碎片，浸入含纤维素酶的缓冲液中保温，悬浮物离心去除细胞碎片。2）将原生体悬浮液滴在无菌滤纸片上，置于含普通植物细胞（滋养细胞）的固体再生培养基表面。原生质体不直接接触滋养细胞，但可吸收其分泌扩散的植物生长因子及其它化合物。3）培养2-3周后，将滤纸上的植物细胞蔟转移至含高浓度分裂素、低浓度生长素的固体培养基上，继续培育2-4周，滤纸片上便长出嫩芽。4）将嫩芽置于含低浓度生长素、无分裂素的固体培养基上，使其根部发育。5）3周后，将之移植于土壤中，长成整株植物。农杆菌介导法、基因枪法回顾新霉素抗性基因（neor）庆大霉素抗性基因（gentr）潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）1）植物基因工程中的选择标记：5、植物基因工程中的选择标记和报告基因-葡萄糖苷酸酶基因（gus）胭脂碱和章鱼碱氯霉素乙酰转移酶基因（cat）荧光素酶基因（luc）绿色荧光蛋白基因（gfp）2）植物基因工程中的报告基因：（四）高等植物的基因表达系统花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子能在许多植物物种、几乎所有发育阶段、所有组织中高效表达，被广泛用于构建转基因植株。启动子是决定基因表达部位、时间、强度的主要调控元件。在高等植物基因工程中，外源基因的时空特异性表达尤为重要，因为很多外源基因的表达产物对植物早期的生长、发育有影响，甚至会致死植株。高等植物的基因表达系统外源基因的四环素诱导系统外源基因的乙醇诱导系统外源基因的地塞米松诱导系统外源基因的类固醇诱导系统1、外源基因的四环素诱导系统Tc-on型四环素诱导系统CaMV35SPPlantnosTGUStet操作子显色反应四环素CaMV35SPPlantnosT-葡萄糖苷酸酶基因GUStet操作子四环素诱导型报告基因表达盒CaMV35SPPlantnosTE.colitetR四环素阻遏蛋白基因表达盒TetRTc-off型四环素阻遏系统35SPPlantnosTGFPtet四环素tTA融合蛋白DNA结合活性转录激活作用tTA激活因子表达盒CaMV35SPPlantnosTtetRVP1635SPPlantnosT绿色荧光蛋白基因GFP四环素阻遏型报告基因表达盒7个tet操作子嵌合启动子Top102、外源基因的乙醇诱导系统CaMV35SPPlantnosT巢曲霉菌alcR转录激活因子表达盒CaMV35SPPlantnosT氯霉素乙酰转移酶基因CAT乙醇诱导型报告基因表达盒alc