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高成功率PCR酶高成功率PCR酶难配对目的片段的扩增粗样品扩增(DNA未纯化)给正为PCR实验烦恼的您ContentsContentsIKODFX的特性III实验例基本篇IIPCR的诸多相关条件VKODFX及相关产品IVFAQ高GC含量目的片段扩增例3扩增效率的比较3可能的扩增片段长度4保真性5全血样品的扩增例(血液直接作为样品使用)5转基因大鼠血液(滤纸血)的GFP基因检测6培养细胞扩增例(细胞悬浊液直接作为样品使用)7通过菌落直接PCR法对酵母转化的确认8经纯化的人类粪便DNA的HelicobactorpyloricagA基因的扩增12人类dystrophin基因的扩增与克隆13用碱裂解法配制的Mousetaillysate的扩增例9直接用Mousetaillysate的转基因小鼠的基因分型10一步法配制的植物裂解液的扩增例11粗样品的PCR粗裂解液的PCR难扩增目的片段的扩增应用篇实验例集实验例集实验例集实验例集KODFX的特性『KODFX』是以具有各种优良特性的PCR酶『KODDNAPolymerase』为基础开发的高性能PCR试剂。本酶显示了出色的「扩增成功率」、「扩增效率」和「延伸性」，对各种长度的目的片段都能进行确实有效的扩增。KOD-Plus-和KOD-Plus-Ver.2是着眼于KODDNAPolymerase的高保真性而开发的，而本酶则是在更注重于「扩增成功率」、「扩增效率」和「延伸性」的基础上开发的（图1）。尤其是KODFX出色的「扩增成功率」，可在以粗样品为模板的实验中得到淋漓尽致的发挥，即便将全血、培养细胞等直接添加到PCR反应液中，也能得到充分的扩增。也就是说，对于原来先将样品中的DNA纯化再进行PCR的实验，如果改用「KODFX」，就无需烦杂的DNA纯化步骤，只需简单的样品前处理即可进行PCR实验。粗样品的PCR扩增!!难配对的目的片段的扩增!!高保真性PCR(克隆用)重视扩增成功率、扩增效率、延伸性重视保真性(约为Taq的80倍)※KODFX和KOD-Plus-系列都采用了使用抗体的热启动法。图1.用KODDNApolymerase的试剂和高保真性PCR酶KOD-Plus-、KOD-Plus-Ver.2等一样，KODFX的PCR产物由于KODDNAPolymerase3’→5’核酸外切酶活性的作用，末端已被平滑化，需要针对平滑末端克隆的方法进行克隆，无法用通常的方法进行TA克隆。因此，和KOD-Plus-、KOD-Plus-Ver.2等一样，需对KODFX的PCR产物进行TA克隆时，请使用专用的TA克隆试剂盒『TArgetClone-Plus-（CodeNo.TAK-201）』。与T载体和DNAligase不一样的是，TArgetClone-Plus-中含有10×A-attachmentmix。由于该10×A-attachmentmix中含有抗KODDNAPolymerase抗体和TaqDNAPolymerase，将该试剂添加到未纯化的PCR产物中，60℃•10分钟加温后很容易在3’末端加dA，加dA反应后，产物即可连接T载体。KODDNApolymerase相关参考文献12PCR的诸多相关条件反应液组成灭菌蒸馏水粗样品相当一步法植物裂解液※虽然KODFX对粗样品有很强的耐性，但当出现无法确认扩增条带的情况时，建议适当减少样品量，以便将阻碍PCR反应的物质的带入量控制在最小范围内。引物条件推荐使用22mer以上的引物。对10kb以上的长目的片段进行扩增时，将引物设计得比通常较长些（27mer以上）能提高特异性，同时，将退火（及延伸反应）的温度设得较高些可得到良好的结果。该条件对Stepdown循环的扩增尤其有效。另外，在对长目的片段进行扩增时，如使用脱盐粗样品等低精度的引物时，会出现Smear、非特异性扩增等情况，此时，建议使用用Cartridge柱或HPLC进行纯化过的引物。推荐以下三种循环条件。一般推荐使用22mer以上的引物，但当引物的Tm值未满73℃时，请用三步法。当使用粗样品时，相比两步法，用三步法能得到更为稳定的结果。在通常情况下，用30个循环即可得到充分的扩增。但根据目的片段长度或样品的不同，会出现扩增效率低下的情况。此时，如将循环次数增加到40～50，即可得到良好的结果。循环条件两步法循环三步法循环Stepdown循环引物的Tm值未满73℃的情况下,请用三步法。MultiplexPCR在MultiplexPCR实验时，当几条引物对摩尔数相同时，某些引物对可能比其他引物对表现出更好的扩增效果。在这种情况下，将扩增效果不佳的引物对的摩尔数增加至原来的1.5倍，PCR循环数略微减少一些，便可得到良好的结果。粗样品扩增KODFX是专为扩增粗样品而开发的试剂盒。详见第Ⅲ部分「实验例」。但当用SDS或ProteinaseK配制的裂解液直接作为样品使用时，有可能会出现酶活性低下、PCR效率极低的情况，请特别注意。实验例基本篇高GC含量目的片段的扩增例用KODFX可对用其他公司PCR试剂无法扩增的高GC含量目的片段进行扩增。人类TGF-β2.3kb(GC含量约70%)1kbDNALadderA公司通用PCR酶（TaqBase）B公司高保真性酶C公司高保真性酶模板引物目的片段循环模板引物目的片段循环模板引物目的片段循环人类基因组※引物的Tm值未满73℃的情况下，请用三步法。人类IGF2R8.9kb(包含GC含量约90%的区域)1kbDNALadderA公司通用PCR酶（TaqBase）D公司LongPCR酶（TaqBase）E公司GCrich用高保真性酶F公司GCrich用LongPCR酶ⅠG公司GCrich用LongPCR酶ⅡH公司高效率LongPCR酶相当※引物的Tm值未满73℃的情况下，请用三步法。扩增效率的比较KODFX对极少的模板量也能显示出出色的扩增能力。A公司通用PCR酶(TaqBase)B公司高保真性酶C公司高保真性酶1kbDNALadder※引物的Tm值未满73℃的情况下，请用三步法。※其他公司的酶，使用各自说明书推荐的条件。3人人基因组人人模板量基本篇可能的扩增片段长度KODFX可对作为模板的λDNA40kb、人类基因组DNA24kb、cDNA13.5kb进行扩增。Template:人类基因组DNATemplate:逆转录反应液(cDNA)模板循环引物模板循环引物人类基因组相当逆转录反应液※引物的Tm值未满73℃的情况下，请用三步法。※引物的Tm值未满73℃的情况下，请用三步法。保真性PCR错误率在KODFX的PCR过程中，产生碱基错配的频率（错误率）144,535个碱基中仅为19个，正确性是Taq及其他公司LongPCR用酶的约11倍。A公司LongPCR用试剂PCR错误率的测定方法以人类基因组DNA为模板，用各酶对β-globin区域2.4kb进行扩增，对PCR产物进行TA克隆后，选择96个克隆进行测序，确认序列。请见P13LongTarget的克隆例。4实验例实验例应用篇粗样品的PCR全血样品的扩增例(直接以血液为样品使用)对血液进行扩增，通常的做法是将血液中的DNA抽提出来再进行基因分析，但该方法的DNA纯化步骤非常烦杂。这里探讨将全血直接作为样品的扩增实验。方法以用EDTA采血管采集的人类全血（1～4μl）为样品，用各种PCR酶对1.3kb的β-globin基因进行扩增。然后，尝试用KODFX对1.3～8.5kb的β-globin基因进行扩增。目的片段反应液组成引物循环参照灭菌蒸馏水全血样品(EDTA采血)※引物的Tm值未满73℃的情况下，请用三步法。结果5结果可见，只有在使用KODFX的情况下，不同的血液量均可得到明亮的扩增。而且，用KODFX可对最大8.5kb的目的片段进行扩增。A公司高效率•高保真性酶TaqBasePCR酶B公司LongPCR酶C公司LongPCR酶样品血液※其他公司的酶，使用各自说明书推荐的条件。样品血液用KODFX，根据血液量的增加，得到的扩增产物也会随之增加。从本次实验的血液添加量来看，KODFX基本上没有受血液中夹杂的抑制PCR反应的物质的影响。因此，KODFX适用于使用血液等的基因分型。探讨实验例应用篇粗样品的PCR引物6转基因大鼠血液（滤纸血）的GFP基因检测目的片段样品需组织物品反应液组成样品方法数据提供生理学研究所安井尚美老师、佐藤KAO理老师为进行小动物基因分析而对其采血是一项非常烦杂的工作。本实验将介绍把血液渗到滤纸中，再以此直接作为样品的简便的PCR分析。参考文献滤纸用Whatman公司灭菌蒸馏水张用剪刀剪下来的滤纸血和滤纸血的采集方法血样的采集用滤纸从大鼠尾巴摄取血液把滤纸放在室温下干燥（1～2小时）用剪刀剪下血液部分直径把剪下的血液作为样品置入20μl反应体系中进行PCR结果阴性样品1阳性样品1阴性样品2阳性样品2※阳性样品使用阳性大鼠的滤纸血，阴性样品使用阴性大鼠的滤纸血。来自某老师的评语只要切开大鼠的尾巴，将流出血液渗到滤纸中即可进行实验，相比以血液、尾巴为样品在离心管中提取DNA的方法，简便了许多，使实验过程变得非常愉快。几乎没有杂带和非特异性条带产生，可检测到非常清晰明亮的条带。三周龄的血液实验例实验例应用篇粗样品的PCR培养细胞扩增例（细胞悬浊液直接作为样品使用）目的片段对培养的动物细胞DNA进行基因分析时，DNA的纯化是个很花工夫的步骤。本实验探讨以培养细胞直接作为样品进行PCR的方法。方法结果�探讨引物反应液组成样品以用DMEM/10%血清培养的Jurkat细胞直接作为样品，尝试对1.3～8.5kb的β-globin基因进行扩增。灭菌蒸馏水参照※引物的Tm值未满73℃的情况下，请用三步法。结果可见，只有在用KODFX的情况下，才能确认到良好的扩增。※其他公司的酶，使用其说明书推荐的条件。A公司高效率•LongPCR酶从上述实验来看，KODFX可对各种长度的目的片段进行扩增，基本上没有受细胞中夹杂的抑制PCR反应的物质的影响。因此，KODFX适用于以培养细胞直接作为样品的基因分析。7实验例应用篇粗样品的PCRProtocol数据提供奈良先端科学技术大学研究生院细胞机能学教研室浮边健老师、大津严生老师、高木博史老师实验例通过菌落直接PCR法对酵母转化的确认引物现在的实验室经常进行Y2H基因分析，但从酵母中抽提DNA是非常麻烦的步骤。本实验探讨以用酶处理后的酵母及酵母菌落直接作为样品的PCR。目的片段样品循环结果实验1实验2实验1实验2实验1实验2�来自老师的评语将Xanthophyllomycesdendrorous克隆后的产物在质粒状态下导入到SaccharomycescerevisiadY187的序列4种（A-D）约3kb其他种类酵母的cDNA文库约500bp4kb用牙签取SaccharomycescerevisiaeY187的菌落少许，在Zymolyase溶液[Zymolyase2.5mg/ml、10mM磷酸钠缓冲液pH7.5、1.2M山梨醇（sorbitol）]10μl中悬浊，取37℃•30分钟孵浴后的溶液1μl（实验2）导入其他种类酵母cDNA文库的SaccharomycescerevisiaeY187的菌落少许灭菌蒸馏水酵母菌落(用接种棒尖少许)实验1中灭菌蒸馏水10μl、样品1μl。A公司通用PCR酶直接用Zymolyase处理后的样品进行PCR1:导入了带有A序列质粒的菌落12:导入了带有A序列质粒的菌落23:导入了带有B序列质粒的菌落14:导入了带有B序列质粒的菌落25:导入了带有C序列质粒的菌落16:导入了带有C序列质粒的菌落27:导入了带有D序列质粒的菌落18:导入了带有D序列质粒的菌落29:带有B序列的质粒（从酵母中抽提）其他公司的酶，使用其说明书推荐的条件。SaccharomycescerevisiaeY187的菌落直接PCR以前我们也曾经用过其他公司的Polymerase对酵母进行菌落PCR，但条件稍有差异(菌落的年龄、使用菌体的量等)即会出现有时可扩增