专题5-课题2-多聚酶链式反应扩增DNA片断

专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断★分子生物学研究中最强大的实验技术之一★其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程美国科学家穆利斯(K.B.Mullis)发明了PCR技术1993年诺贝尔奖㈠.DNA分子的结构C、H、O、N、P1.元素组成：脱氧核苷酸2.基本单位:一.基础知识脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第3位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’、磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端3.多脱氧核苷酸链得形成多脱氧核苷酸链结构简图4.DNA分子的双螺旋结构⑴.DNA分子是由的（即一条链为3’－5’，另一条链为5’－3’）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则结构。⑵.与交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；排列在链的内侧。⑶.两条链上的碱基通过连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与配对，一定同胞嘧啶配对。双螺旋两条反向平行脱氧核糖磷酸碱基氢键胸腺嘧啶鸟嘌呤㈡.DNA的复制2.时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期。3.场所细胞核（主要）、线粒体、叶绿体。1.概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。4.基本条件酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四种脱氧核苷酸模板:DNA的两条链⑴.边解旋边复制(过程）5.复制特点⑵.半保留复制（结果）6.遵循原则：碱基互补配对原则7.精确复制的原因8.复制的意义DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性⑴规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板⑵碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物总结：胞内DNA复制的基本体系打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸㈢.PCR(多聚酶链式反应）2.DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。3.DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。1.定义：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。4.PCR原理⑴.在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。⑵.当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。⑶.PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。5.TaqDNA聚合酶的应用6.需要为PCR反应提供的物质缓冲液、DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出。7.PCR技术的特点：8.细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制PCR模板(母链)引物原料:dNTP聚合酶反应环境细胞内源引物合成酶细胞内的环境细胞内源细胞内源外源加入缓冲液外源加入外源加入外源加入⑴.PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸9.细胞内复制和PCR不同点⑵.PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的10.PCR的重要应用：广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。1、PCR仪㈠.设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器。二.PCR的实验操作2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。1.准备2.移液㈡.实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。3.混合⑴过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4.离心⑵离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。5.反应循环数变性复性延伸第一次94℃，10min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸.⑴.变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。⑵.复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。⑶.延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。靶序列靶序列PCR循环第一步：高温变性PCR循环第二步：引物与靶序列退火PCR循环第三步：引物延伸第1个PCR循环完成后：得到两个靶序列PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6.注意事项⑴隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；⑵分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头㈠.理论上DNA扩增数目的计算三.课题成果评价1.一条DNA，复制n次，DNA为2n2.a条DNA，复制n次，DNA为a×2n㈡.实验中DNA含量的测定1.原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。2.过程⑴.稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释.⑵.对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值⑶.计算⑷.计算DNA含量(g)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数50：1g/ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0.02光吸收波长／nm2602402202800.10.2比色杯四.课题延伸例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达230个拷贝（109拷贝）PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出特点五.实验小结PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72℃