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第八章外源化学物的致突变作用2遗传毒理学第一节基本概念第二节化学毒物致突变的类型第三节致突变作用机制和后果第四节机体对致突变作用的影响第五节观察化学毒物致突变作用的基本方法3基本概念遗传毒理学(GeneticToxicology)是毒理学的一个分支，研究外源化学物及其他环境因素对生物体遗传机构的损害作用及其规律。其主要目的是检测那些能引起DNA损伤的环境因素，研究其遗传毒作用的特点及对人类的潜在危害。4基本概念突变(mutation)遗传结构本身的变化及其引起的变异称为突变，突变实际上是遗传物质的一种可遗传的变异。自发突变(spontaneousmutation)由于自然界中诱变剂的作用或由于偶然的自制、转录、修复时的碱基配对错误所产生的突变。诱发突变(inducedmutation)诱变剂诱发的突变。5致突变作用或诱变作用(mutagenesis)广义概念是外来因素，特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。简单地说，突变的发生及其过程即为致突变作用。化学诱变剂(chemicalmutagen)基因突变(genemutation)一个或几个DNA碱基对的改变染色体畸变(chromosomeaberration)染色体的结构及数目改变基本概念6DNA与基因:基因(gene)基因组(genosome)染色质(chromatin)与染色体(chromosome)体细胞(somaticcell)和生殖细胞(germcell)基因型(genotype)与表型(pheotype)细胞周期(cellcycle)、有丝分裂(mitosis)与减数分裂(meiosis)基本概念7基本概念8基本概念9基本概念10基本概念11基因突变（genemutation）染色体畸变（chromosomeaberration）非整倍体和多倍体(aneuploidyandpolyloid)化学毒物致突变的类型12化学毒物致突变的类型一、基因突变(genemutation)1．碱基置换(base—pairsubstitution)指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。转换(transition)颠换(transvertion)2．移码突变(frameshiftmutation)指发生一对或几对（三对除外）的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。13一、基因突变(genemutation)化学毒物致突变的类型14化学毒物致突变的类型一、基因突变(genemutation)15二、染色体畸变(chromosomeaberration)指染色体的结构改变染色单体型畸变(chromatid-typeaberration)染色体型畸变(chromosomeaberration)染色体畸变裂隙(gap)断裂(break)断片(fragment)和缺失(deletion)微小体(minutebody)无着丝点环环状染色体双着丝点染色体倒位(inversion)易位(translocation)插入(insertion)和重复(duplication)辐射体化学毒物致突变的类型16染色体缺失及环状染色体的形成图染色体插入和重复示意图17染色体的臂间倒位染色体相互易位示意图18二、染色体畸变(chromosomeaberration)化学毒物致突变的类型19三、基因组突变1．非整倍体非整倍体(aneuploid)指细胞丢失或增加一条或几条染色体。缺失一条染色体时称为单体(monosome)，增加一条染色体时称为三体(trisome)。染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如21三体导致先天愚型(Down氏综合征)。2．整倍体整倍体(euploid)指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如形成三倍体(triploid)、四倍体(tetroploid)等。在人体，3n为69条染色体，4n为92条染色体。在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。化学毒物致突变的类型20致突变作用的机制一、DNA损伤与突变(一)碱基损伤1.碱基错配2.嵌入DNA链3.碱基类似物的取代4.碱基的化学结构改变或破坏21一、DNA损伤与突变（二）DNA链受损1.二聚体的形成2.DNA加合物（DNAadducts）形成3.DNA-蛋白质交联物(DNA-Proteincrosslinks，DPC)形成二、引起突变的细胞分裂过程的改变（对纺锺体的毒作用）三、其他的改变对DNA合成和修复有关的酶系统作用可间接导致DNA损伤，诱发基因突变或染色体畸变。致突变作用的机制22突变的不良后果突变的不良后果体细胞突变生殖细胞突变癌变致畸衰老配子死亡死胎自发流产先天畸形23一、机体修复DNA损伤的机制可分为两大类：1.损伤耐受机制：指DNA遗传可绕过那些阻止DNA复制的DNA损伤。2.修复机制：DNA修复直接修复切除修复O6甲基鸟嘌呤修复光修复错配碱基修复碱基切除修复核苷酸切除修复机体对致突变作用的影响复制后修复呼救性修复24机体对致突变作用的影响二、遗传因素对致突变作用的影响：(一)代谢酶遗传多态性(二)修复功能的个体差异25观察化学毒物致突变作用的基本方法一、观察项目的选择1．观察的效应终点类型基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点(geneticendpoint)。26观察化学毒物致突变作用的基本方法一、观察项目的选择遗传学终点分为5类：①DNA完整性的改变(形成加合物，断裂，交联)；②DNA重排或交换；③DNA碱基序列改变；④染色体完整性改变；⑤染色体分离改变。其中③实际上指基因突变，④指染色体畸变。27观察化学毒物致突变作用的基本方法2．成套的观察项目遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。因为：①化学毒物的种类和结构多种多样，其致突变的机制不尽相同，作用的靶细胞也不一样，有的是体细胞，或生殖细胞，或两者兼而有之，故在成套观察项目中既要用体细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平还要从细胞水平来检测化学毒物的遗传毒性。②致突变物中仅少数具有直接致突变作用，大多数为间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才具有致突变作用。体内试验具有完整的活化系统，而体外试验则通过加入模拟代谢系统，如S9来弥补缺乏活化系统的不足。这是体内与体外试验的主要差别。③化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的致突变物。对于弱致突变物在某些系统中比较容易漏检，即出现假阴性。282．成套的观察项目关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可入选的原则有：①选择的遗传毒性试验应包括5种类型的遗传学终点。②通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。③体内试验与体外试验配合。④应包括生殖细胞和体细胞。通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，再行选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害的评价。观察化学毒物致突变作用的基本方法29二、常用的致突变试验(一)细菌回复突变试验(Ames试验)鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+)组氨酸营养缺陷型突变株。(his-)正向突变回复突变代谢活化系统受试物观察化学毒物致突变作用的基本方法30二、常用的致突变试验(二)微核试验微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。在细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。微核试验(Micronucleustest，MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。观察化学毒物致突变作用的基本方法31观察化学毒物致突变作用的基本方法(二)微核试验32MNNCE观察化学毒物致突变作用的基本方法33二、常用的致突变试验(三)染色体畸变分析(四)姐妹染色单体交换试验（SCE）观察化学毒物致突变作用的基本方法34二、常用的致突变试验(五)果蝇伴性隐性致死试验(六)显性致死试验(七)程序外DNA合成试验(八)转基因动物致突变试验(九)哺乳动物细胞基因突变试验(十)SCCE试验(十一)荧光原位杂交技术观察化学毒物致突变作用的基本方法35三、致突变试验中的一些问题(一)阴性和阳性对照的设立1．阴性对照它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础数据。例如，Ames试验的阴性对照可了解所用的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外无任何使回复突变率增加或减少的因素。2．阳性对照是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，Ames试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。观察化学毒物致突变作用的基本方法36三、致突变试验中的一些问题(二)体外试验的活化系统1．哺乳动物细胞介导使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9，但不如体内活化系统。2．S9S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺点是S9随实验动物种属或器官不同而有差异；S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。3．纯化酶和基因工程应用纯化细胞色素P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素P-450基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。观察化学毒物致突变作用的基本方法37三、致突变试验中的一些问题(三)致突变试验与致癌试验的关系①已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。②发现人类接触致癌物与DNA加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。③传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。观察化学毒物致突变作用的基本方法38三、致突变试验中的一些问题(四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用阴性结果判定条件：①最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD50或LD80为最大剂量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验中可以5000μg／皿作为最