― 方法学验证中各项指标的深度剖析

谢沐风上海市药品检验所xiemufeng@sina.com一、线性试验主成分含量测定以测定浓度为100%，50%~120%之间选取5个点即可。溶出（释放）度测定以释放量的10%～120%间选取5个点即可。杂质含量用杂质对照品准确测定以杂质限度为100%，50%~120%之间选取5个点即可。测定结果：1）阐述如何看待截距和斜率、如何应用。2）误差在哪里，应用时的注意事项。3）为什么没有不成线性的？通常C、H、O、N结构，紫外监测器决定。个别化学键所致。梯度洗脱时，有时会出现不成线性。4）都成线性、为何还要做？最小二乘法的原理知晓。唑来磷酸结构式引申使用：1）有关物质测定归一化法和自身对照法的相互妙用。2）缓释制剂溶出度测定，对照品浓度设定为中间浓度。举例说明。3）回收率试验为何做80%~120%即可？亦及样品浓度与对照品浓度接近到何等程度的理解。4）国内只注重相关系数，不注重截距。二、精密度试验重复性试验：连续进样6次。中间精密度试验和重现性试验通过“耐用性试验中的溶液稳定性试验”来体现。浓度极低时才会不理想，加大进样量。色谱峰形极为重要，对称性、柱效等参数。加大柱温、增加流动相中有机相比例，使被测物质峰尽快出峰。三、准确度试验用回收率来衡量作法：在80%~120%间选择3点或5点，原因是由外标一点法决定的。已知杂质、且有杂质对照品的，可采用加入法，即加样回收率来评价。一般情况下，只要空白辅料无干扰，回收率均是良好的！四、专属性有关物质为主，其他检测项目（含量）基本上均参照有关物质。有关物质的验证，采用中间体和降解产物（确认结构后人工合成）来验证与主成分的分离。系统适用性试验的配制方法：在100％浓度的主成分溶液中加入1%浓度的杂质对照品，以模拟样品中有可能存在的状态。介绍配制方法——先配制杂质贮备液，再用供试品溶液（或浓的对照品溶液）来稀释，简便、易行！专属性试验验证图谱存在问题——配制相同浓度，测定样品时，主成分峰骤然加大，将杂质峰覆盖。强破坏试验的目的：验证药品在遭遇了极端的气候环境条件下产生的杂质，在所建立的色谱条件下是否能够分离、测定。●检测波长的确定涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分）选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f1.0），否则将得到错误的判断。介绍该项检测的由来和历史背景要看主峰里是否有杂质，如何判断？但需注意DAD检测器的局限性，介绍“土办法”！结果：目前从来没有推翻现行色谱条件的。意义在哪里。如何应用，拿到只是“走形式”？最小峰面积的设定●其设定，不是绝对值，而是相对值。●英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测定时，通常为1/10~1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。●原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。强力破坏试验●水破坏取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。●氧化破坏取原料适量，用5%过氧化氢溶液溶解后，在90℃放置24小时。●强碱破坏取原料适量，用1mol/L氢氧化钠溶液溶解后，在90℃放置24小时。●强酸破坏取原料适量，加1mol/L盐酸溶液溶解后，在90℃放置24小时。●高温破坏取原料适量，依据各自品种的熔点不同，在高温下破坏至外观性状改变●强光破坏取原料适量，置紫外灯下照射48小时。四、检测限●信噪比的三倍——纯属“纸上谈兵”，实际测定中根本用不上。●是相对值，不是绝对值。是相对于供试品溶液浓度的多少分之一而言，一般至少要在5000倍以上。浓度进样量绝对值相对于样品测定浓度的最大进样量50mg/ml以上20μl供试品溶液5mg/ml20μl100μg100%（5000倍）对照溶液50μg/ml20μl1μg1%最低检出量1μg/ml20μl20ng0.02%有关物质、含量与自身对照三者浓度的关系积分参数的设定●积分参数的设定是非常重要的。由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(MinArea)组成。●采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。●供试品溶液最小峰面积的设定将直接导致测定结果。设定得太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定得过大，又将反映不出杂质情况。方法学认证中的耐受性试验是指更换试验因素，如不同人员、不同仪器，不同色谱柱型号、厂家，不同试剂等因素。这一点才是真正至关重要的！认证时不可能做到这一点，出现问题时往往要考虑到。方法学认证中溶液稳定性的全面判定不能单从主成分入手！还要注意所有组分的百分比变化，绝对值变化！min024681012141618202224mAU60708090100110120130140150160mAU60708090100110120130140150160917085.9230.86104328888.41098.165918514.6260.564500222.7290.422:210nm,8nm傾乕僥僗僱乕僩昗弨梟塼傾乕僥僗僱乕僩昗弨梟塼02-Rep4柺愊曐帩帪娫柺愊%杂质-1（为已知杂质）青蒿琥酯杂质-2杂质-3新杂质时间(h)峰面积百分比峰面积百分比峰面积百分比峰面积百分比均未检出0148110.14%1036960099.26%575110.55%50320.05%0.5360280.35%1014652598.89%557860.54%223310.22%1595200.57%1038238898.58%580980.55%317170.30%1.5689800.66%1034454198.45%595210.57%338980.32%2789480.75%1036038698.33%591720.56%380650.36%3917080.86%1043288898.16%591850.56%4500020.42%RSD0.96％流速、柱温与溶剂的选择●在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，且使主成分峰不拖尾即可。●柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。●溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。质量标准中制订有关物质的原则●采用杂质对照品法、用于降解产物的准确测定，如氢氯噻嗪、对乙酰氨基酚等。●采用强破坏试验破坏出杂质。如中国药典中的氧氟沙星所有品种，均在HPLC法的色谱条件下拟定了：取供试品溶液，置紫外灯下（254nm）照射4小时以上，使产生的紧邻主峰前的杂质峰与主峰的分离度应符合规定。●不采用任何方式。典型强破坏试验图谱min0510152025303540mAU0246VWD1A,Wavelength=280nm(XMF\05112203.D)15.753min0510152025303540mAU0246VWD1A,Wavelength=280nm(XMF\05112204.D)14.81215.928min0510152025303540mAU0246VWD1A,Wavelength=280nm(XMF\05112205.D)