第七章超高效液相色谱法

超高效液相色谱法（UPLC）色谱实验室的新高度•Jorgensen博士和杨百翰大学的M.Lee博士最近都发表了关于色谱实验室未来分析范围的深刻见解。他们的研究为分离科学描绘了一幅新图景。通过使用比以前小得多颗粒，使分离过程达到了一个新的终点。•范第姆特方程是一个描述线速度与塔板高度（柱效）关系的经验式。从图1可以看出，一旦填料的颗粒大小低于2μm，色谱技术就能达到一个新水平：不仅柱效更高，而且随着流速的提高不会使柱效降低。•如果使用UPLCTM技术和2μm以下的颗粒，那么即使在较高的线速度下，效率也能得以保持。更短色谱柱和／或更高流速的使用加快了分析速度，提高了分辨率和灵敏度，从而使现在有可能充分利用色谱原理进行分离。•峰容量被定义为色谱法每单位时间内所能分辨的峰数量。峰容量和分离速度等性能指标得到提高后的色谱法被称为超高效液相色谱法，或UPLC。图2说明了当颗粒大小从5μm减小至1.7μm时，增加的峰容量对色谱分离性能的影响。•源于更小颗粒的额外效率可带来更多的明显益处。更短的色谱柱或更高的流速加快了速度，同时小颗粒也提高了分辨率。对于任何给定的分离，都可通过调节这些变量而达到速度和分辨率的最佳组合该头发的直径约等于12个5μm的颗粒，33个1.7μm的颗粒。•图4显示出了目前实验室常用的5μm颗粒与建议用于UPLC柱的更小的1.7μm颗粒的明显差异。目前，非多孔型1.5μm颗粒已经上市。虽然这类颗粒效率较高，但它们的缺点是表面积较小。表面积小会导致载样量小和保留时间短。为了与HPLC保持相近的保留时间和载样量，UPLC必须使用多孔型颗粒。•UPLC需要一种新颖的耐高压多孔型颗粒。填充床的均匀性也是至关重要的；特别是当较短的色谱柱用以保持分辨率的稳定，而同时又要达到加快分离速度的目标时。另一项要求是色谱柱的内表面必须足够光滑，以便于填充较小颗粒。应重新设计色谱柱两端的筛板，使之既能留住小颗粒又能避免堵塞。•3μm是15cm长普通色谱柱颗粒大小的极限。这是在色谱柱达到最佳流速而又不超出市售仪器（使用任何配比的甲醇－水混合溶剂）的压力限制范围的条件下，运行系统所能使用的最小颗粒大小。（注意：迄今为止，用于HPLC的最小颗粒是0.67μm•为了达到颗粒小、峰容量大的分离效果，需要比目前使用的HPLC仪具有更广的压力范围。在能达到最大效率的最佳流速下，对于10cm长装有1.7μm颗粒的色谱柱，计算得出的压力降是15,000psi。因此，需要一个能在该压力下传送溶剂的泵。•在这些条件下，溶剂的可压缩性将会变得显著，特别是在多溶剂和梯度分离条件下。UPLC的溶剂传送系统应不仅仅具有高压泵抽吸功能，同时在等度和梯度分离模式下使用各种溶剂，溶剂传送系统必须能抵消溶剂可压缩性引起的大范围潜在压力波动，以实现平稳而可重现的流体输送。•普通进样阀，不论是手动的还是自动的，都不具有极端压力下的耐用功能。进样的可重现性和线性的典型性能标准是分析应用所需要的•为保护色谱柱免受极端压力波动的影响，进样过程应尽可能排除脉冲干扰。仪器的系统体积要小，以减小所检测样品可能的区带展宽。在快速进样循环中，UPLC能以最大速度、较大的样品通量进行工作•理论情况下，配备1.7μm颗粒的UPLC系统能产生半峰宽小于1秒的检测峰。这给UPLC检测带来了挑战。首先，检测器必须具有较高的采样速率，以在检测峰通过时捕捉足够的数据点，从而对分析物的检测峰进行准确而可重现的识别（和积分）•检测器必须有最小的扩散体积，以确保分离效率不降低。检测器的光学部件也必须具有能体现UPLC灵敏度优势的性能指标。从概念上讲，对于不同的检测技术，UPLC检测的灵敏度应是HPLC分离灵敏度的2-3倍（图5）。例如，质谱检测会极大得益于UPLC的性能特征,使与UPLC相连的质谱仪的灵敏度至少提高3倍在进行高峰容量的色谱分析时，降低分析物的色谱展宽可能有助于提高灵敏度•除了化学、泵、进样器和检测器之外，还需要对系统进行考虑。系统的体积至关重要。如果要在色谱分析过程中保持UPLC分离的高性能，则UPLC的系统总体积必须大大低于目前的HPLC系统.如：考虑连接管和接头配件UPLC技术能实现提高液相色谱速度、分辨率和灵敏度的承诺，为每次分析提供更多的信息；因此，该技术将会得到实验室的广泛认可。超高效液相色谱法（UPLC）相对于高效液相色谱法（HPLC）的优势所在：•1.速度•超高效液相色谱法（UPLC）采用新型全多孔球形1.7μm反相固定相，该固定相是应用“杂化颗粒技术”（hybridparticletechnology，HPT）合成的，并由此制备了高柱效的ACQUITYUPLC色谱柱。这使得在常规高效液相色谱需要30分钟时间的样品分析在超高效液相色谱短短为仅需5分钟，并呈现出色谱柱柱效达20万块/m理论塔板数的超高柱效。•2.灵敏度•我们知道UPLC色谱柱中使用的是1.7μm固定相，分离获得的色谱峰半蜂宽小于1s，这就对检测器的要求是极高的。AQUITYUPLC使用采样速度达40点/s，池体积仅为500nL（约为HPLC池体积的1/20）的新型光导纤维传导得流通池，当光束通过光导纤维进入流通池后，利用聚四氟乙烯池壁的全析射特征，不损失光能最，而使检测灵敏度比HPLC增加2～3倍。光源可使用可变波长的紫外光或二极管阵列系统。•3.自动化•对于UPLC的进样系统，常规的手动进样阀和自动进样阀都不能满足系统需求了。在UPLC中为保护色谱柱不受极端高压力波动的影啊，进样过程应当相对无压方波动，进样系统的死体积必须足够小，以降低样品谱带的扩展。•UPLC的自动化进样器的设计有了新突破：针内针进样探头（XYZZ）为高速进样机械装里，可快速进样。针内针的含义是使用液相色谱管路（PEEK材料）充当进样针以减少死体积，而“外针”是一小段硬管，用来扎破样品瓶盖；压力辅助进徉。为了降低进样时的交叉污染，采用一强、一弱的双溶剂的进样针清洗步骤，这两种洗针溶剂需同时得到良好的脱气。•此技术可保证可靠、重现的进样；在自动进样器内，可安置96位或384位样品盘。每个位置可放置2或4mL样品瓶。新型的样品组织器可接受21个样品盘的编程。•与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。•因此其在蛋白质、肽、代谢组学分析及其它一些生化领域里将会得到广泛应用。另外，在天然产物的分析方面，使用UPLC与质谱检测器连接，会对天然产物分析，特别是中药研究领域的发展是一个极的促进。•在提到“蛋白组学”或“代谢组学”时，与没有“组”的差别从分析的角度说就是样品量极大，需要在短时间分析成千上万的样品。UPLC不损失分离度的高速度优点在里就能充分体现。多生化样品及天然产物都十分复杂，WatersUPLC超高效液相色谱超高效液相色谱仪NexeraUHPLCLC-30A•通量最大化：•1、超高速/超高分离度分析•承受最大压力高达130MPa。•2、超快速进样•通过重叠进行，使进样时间最短，每次进样仅需10秒。•3、样品容量最大化•Nexera换架器，可处理多达4600种样品；多路系统•（MPX）。••性能最优化：••1、微量分析时，交叉污染最小化•以最小的接触面积通过进样针；可以使用多种溶剂（最多4种）彻底清洗样品流路和进样针表面。••2、以最小的体积，精确并准确地进样•使用高分辨率计量泵直接进样；计量泵独立于流路之外。•3、在超快速条件下，保证良好的梯度重现性•高分辨率梯度控制；MiRC混合器的有效混合机制•4、适用于UHPLC的均衡色谱柱加热•IHB控制的柱间温度分布最小化；通过微体积预热器，有效预热。扩展性最大化•1、可升级的UHPLC组件设计•通过组合常用的HPLC组件，可以自由地配置系统。•2、使用自动进样器，对样品进行自动前处理•可以进行柱前衍生、内标物添加以及样品稀释。••3、高温分析•柱温最高达150℃；高温促使新技术的应用，比如绿色色谱法（GreenLC）。4、高速LCMS分析•与超快速LCMS、LCMS-2020相结合。头发中烟碱和可替宁的超高效液相色谱测定•烟碱(nicotine)是烟草中的主要生物碱,是导致吸烟成瘾的物质动因,也是评价人体摄入烟草烟雾的常用指标。•可替宁是烟碱在体内的主要代谢产物,是评价烟草烟雾摄入量的生物标志物•测定发样中烟碱和可替宁的含量水平可以反映人群较长期对烟草烟雾的暴露情况,可以为流行病学调查提供定量依据,用于评价烟草烟雾对人体健康的影响。•本文了UPLC法测定主动吸烟人群和被动吸烟人群头发中的烟碱和可替宁试验日本岛津超快速液相色谱仪PromineneceUFLC快速分析作为重要技术课题一直以来都在使用，但伴随LCMS的迅速普及，提高性价比成为迫在眉睫的问题，成为了加紧快速化的重要因素。快速分析即缩短分析时间，通常通过缩短色谱柱或提高流动相的流量来达到目的•使用小粒径的填料•通过这个方法将使快速分离成为可能。但是，由于色谱柱里流动阻力的增加，仪器各部件和色谱柱所承受的压力也将显著地增加•高温分离•较高的温度可以加速物质的扩散，同时可以减小色谱柱里的流动阻力，也使得快速分离成为可能。•高温分析在降低柱压方面很有效，但是高温引起色谱柱的劣化、导致样品分解等不足在应用时需要引起注意。•UFLC通过以下特性支持快速分析：•小柱管和小体积的流通池降低了柱外峰展宽效应。•使用2.2μm颗粒大小的色谱柱自动进样器实现10秒钟10μl的超快速进样支持高达85℃的高温分析。温度与快速分析：随着柱温升高，理论塔板数增加，柱效增高，柱压降低。•温度对化合物的影响：高温分析在降低柱压方面很有效，但是高温引起色谱柱的劣化、导致样品分解等不足在应用时需要引起注意。高温分析只是作为快速分析的辅助手段加以运用。•具备高采样频率的检测器，可以实现快速的数据获取而不会丢失信息。•专门的色谱方法转换软件，使常规色谱条件转换为UFLC条件简单易行，保证分析方法的通用性。•快速分析的重现性在快速分离中要取得成分保留时间的重现性要比常规分析中更加困难。保留时间的重现性（RSD）和时间的平方根成反比增大，所以需要比常规分析更为严格的送液性能。ProminenceUFLC可以保证送液分辨率3nL/min的微冲程送液、梯度送液时控制响应为0.1秒的卓越送液能力，可以发挥极为优越的保留时间重现性。•什么是高通量快速液相色谱的目标就是高通量，也就是说每天或每小时有更多的样品被分析。为了实现高通量，不仅要缩短单个样品分析时间，而且整个循环进样和分析时间也必须优化。追求快速化的本意不仅是缩短分析时间，而且是缩短分析周期。ProminenceUFLC的样品注入速度为10秒，使得分析周期得以大为缩短。PTC衍生氨基酸的UFLC分析多环芳烃(PAHs)的UFLC分析•2004年waters推出了UPLC（UltraPerformanceLC®）•2005年jasco推出了XPLC•2006年shimadzu推出了UFLC•thermofisher推出了UHPLC超高效液相色谱(Ultra-HighPerformanceLiquidChromatography,UHPLC)工作压力超过6,000psi,工作温度超过环境温度,更高级固相（其颗粒远远小于传统的5μm直径硅胶）•Agilent推出了RRLC高分离度快速液相色谱系统的分析速度可以比标准液相快20倍，同时分离度提高60%。•UHPLC是AGILENT推出的RRLC的升级版,•RRLC的柱压只能达到600巴,UHPLC可以达到1000巴,•日本分光公司极限高压液相色谱（XPLC）系统,压力超过了15，000p