核酸药物

第七章核酸药物nucleicacidmedicine依据化学结构和组成分类：分四类核酸碱基及其衍生物1核苷及其衍生物2核苷酸及其衍生物3多核苷酸41.核酸碱基及其衍生物;别嘌呤醇(Allopurinol)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、磺硫嘌呤(Tisupurine)、氟尿嘧啶等2.核苷及其衍生物：腺苷类：腺苷、腺苷甲硫氨酸（SAM）、阿糖腺苷(Ara-A)等尿苷类：尿苷、呋喃氟尿嘧啶、氮杂尿苷(Azauridine)等胞苷类：阿糖胞苷(Ara-C)、环胞苷、氮杂胞苷等肌苷类：肌苷、肌苷二醛、异丙肌苷等脱氧核苷类：氮杂脱氧核苷、脱氧硫鸟苷等3.核苷酸及其衍生物：单核苷酸类：AMP、UMP、IMP、cAMP、CoA等核苷二磷酸类：尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱(CDP-Choline)核苷三磷酸类：ATP、CTP、UTP、GTP等核苷酸类混合物：5－核苷酸、2－核苷酸、3－核苷酸等4.多核苷酸：二核苷酸：CoⅠ、CoⅡ、黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）多核苷酸类：RNA、DNA、polyI:C、polyA:U、转移因子（TF）等依据结构特点及临床应用情况分类具有天然结构的核酸类物质如：肌苷、ATP、GTP、CTP、UTP、CoⅠ等来源：提取或发酵特点：毒副作用小自然结构碱基、核苷、核酸类结构的类似物如：巯嘌呤、阿糖胞苷、聚肌胞等来源：以核酸类物质为前体通过“化学法”或“酶法”进行半合成特点：毒性较大第一节核酸类物质的分离提取及其发酵生产一、RNA与DNA的提取与制备（一）RNA的提取与制备1、工业用RNA的提取（1）RNA及其工业来源来源：一些最常见的菌体含有丰富的核酸资源，如酵母、白地霉、多种抗菌素的菌丝体——青霉素，制霉菌素等菌体。通常在细菌中RNA占5％～25％，在酵母中占2.7％～15％，在霉菌中占0.7%～28％。在菌体内RNA含量的变化受培养基组成影响，其中关键是铵离子浓度和磷酸盐浓度。培养酵母菌体收率高，易于提取RNA。很显然在许多酵母中，早期细胞中的RNA含量高，其确切数值取决于碳、氮比例和培养基组成等。（2）高RNA含量酵母菌株的筛选可以从自然界筛选到RNA含量高的酵母菌株，也可用诱变育种的方法提高酵母菌的RNA含量。稀碱法：是用氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来。需用酸中和PH7。然后除去菌体，将pH调至RNA的等电点（pH2.5），使RNA沉淀出来。上法的缺点是制得的RNAMr较低,(磷酸单脂酶、磷酸二脂酶降解RNA，90℃保持3~4h破坏酶)。浓盐法：是用高浓度盐溶液（6%~8%）处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。苯酚法：要避免分子降解，可采用苯酚法制备RNA。用苯酚处理生物材料，使蛋白质变性，然后离心，上层水溶液内含有全部RNA，可用乙醇沉淀出来。脱氧核糖核蛋白溶于浓盐溶液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。（4）RNA的提取实例：啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH3g的水，20℃以下缓慢搅拌30分钟。用6mol／LHCl调至pH7，搅拌15分钟，离心得清液255m1。冷至10℃以下，6mol／LHCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNAl.8g（纯度80％）。2、具有生物活性RNA的制备2.具有生物活性RNA的制备核糖核蛋白的提取：组织匀浆匀浆液0.14MNaCL提取离心上清液（核糖核蛋白）调pH4.5，离心沉淀设法将核酸和蛋白分开（核糖核蛋白）从核糖核蛋白中分离RNA(1)乙醇沉淀法：核糖核蛋白溶于NaHCO3水相用含辛醇的氯仿去蛋白乙醇RNA沉淀(2)盐酸胍法：核糖核蛋白2～4盐酸胍38OC溶解冷却至0OC离心RNA沉淀（二）DNA的提取与制备1．工业用DNA的提取取新鲜冷冻鱼精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100℃，保温15分钟，迅速冷却至20～25℃，离心除去鱼精蛋白等沉淀物，获得35L含热变性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶法降解生产脱氧核苷酸。如要制成固体状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95％乙醇，离心可获得纤维状DNA，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，减压低温干燥得DNA粗品，产品含热变性DNA50％～60％。2、具有生物活性DNA的制备动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量生理盐水经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500r／pm离心30分钟，沉淀用同样体积的生理盐水洗涤3次，每次洗后离心，将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，再捣碎3分钟，加入2倍量5％的（用45%乙醇作溶剂）十二烷基磺酸钠，并搅拌2～3小时，在0℃2500r／pm离心，在上层液中加入等体积的冷95％乙醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5％十二烷基磺酸钠达1／10体积，搅拌1小时，经5000r／pm离心1小时，清液中加入NaCl达1mol／L，再缓慢加入冷95%乙醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生物活性的DNA（活性DNA制备需在0～3℃操作）。2.具有生物活性DNA的制备动物内脏生理盐水捣碎1min【负提取】离心30min沉淀生理盐水洗3次沉淀【提取】SDS－乙醇－水离心【沉淀】乙醇上层液沉淀【干燥】固体DNA(粗)（有活性）粗品DNA加水溶解加5％SDS溶液至1/10体积搅拌1h，离心1h上清液NaCl至1M冷乙醇DNA沉淀二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸1、酶解法制备脱氧核苷酸桔青霉产生5`-磷酸二脂酶红酵母产生3`-磷酸二脂酶2、酶解法制备戊糖核苷酸我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸，日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。酶解法生产5‘—单核苷酸工艺流程3、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（I＋G）呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商品名简称为（I＋G），用核酸酶Pl降解RNA可获得GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生产（I十G）工艺。4．菌体自溶法生产核苷酸磷酸二酯酶在合适的条件下降解细胞内的RNA可产生5′-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5‘-核苷酸。（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：5．碱水解法生产2＇，3＇-混合核苷酸RNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生成2′，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，很易加水分解生成2＇，3＇-混合核苷酸。取RNA配成3％～3.5%的水溶液，加氢氧化钠达0.3mol／L浓度，升温至38℃，保温16～20小时，用6mol／L盐酸中和至pH7.0，从RNA水解成2′，3＇-核苷酸的降解率达95％以上，将2′，3＇-混合核苷酸制成每片含50～100mg的片剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。（二）发酵法生产核苷酸1．发酵法生产肌苷酸（IMP）2、发酵生产黄苷酸（XMP）及酶法转化成鸟苷酸发酵法生产核苷酸产氨短杆菌发酵生产肌苷酸（IMP）：腺嘌呤营养缺陷型嘌呤核苷酸生物合成途径和代谢调控R5PPRPPPRPP转酰胺酶PRAIMP分解腺嘌呤阻遏GMPAMPADPATP反馈抑制SAMPAMPADPATPXMPGMPGDPGTP鸟嘌呤PPGMPATPPRPPGTP次黄嘌呤鸟嘌呤GMPIMP积累的主要途径（前提）◆保证IMP合成路线畅通：保证关键酶PRPP转酰胺酶的活力---解除腺嘌呤及衍生物的组遏和反馈抑制，◆阻断IMP的去路：阻断SAMP合成阻断IMP的分解筛选获得缺乏SAMP合成酶的腺嘌呤缺陷菌株，提供亚适量的腺嘌呤。◆使积累的IMP渗透到细胞外：增大细胞膜通透性选育Mn2+不敏感的变异株枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸合成途径SAMPAMPIMPGMPXMP345678黄嘌呤缺陷型（II）鸟嘌呤缺陷型（经诱变缺失4号酶）（III）鸟嘌呤缺陷型（经诱变缺失4号酶）腺嘌呤缺陷型（经诱变缺失6号或7号酶）AICARSAICARPRAPRPP21（一）（一）（一）（一）1：PRPP转酰胺酶2、7：SAMP裂解酶3：IMP脱氢酶4：XMP氨化酶5：GMP还原酶6：SAMP合成酶8：AMP脱氢酶当培养基中提供限量腺嘌呤时Ⅰ积累IMP肌苷Ⅰ＋Ⅱ积累IMP肌苷Ⅲ积累XMP黄苷枯草杆菌的磷酸单酯酶活力很强ADP（Ⅰ）（三）半合成法制备核苷酸由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5′-核苷酸收率可达90%。例一：肌苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三乙酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmol／L，反应2h，5＇-IMP摩尔产率达91％。例二：鸟苷2mmol／L悬浮于5ml磷酸三甲酯中，温度控制0℃，添加氯化氧磷6mmol／L，水2mmo/L，反应6h，5＇-GMP摩尔产率达90%。三、核苷的制备本节叙述核苷的化学法和发酵法生产。（－）RNA化学水解法制备核苷1．核苷生产工艺流程RNA经甲酰胺化学水解制备核苷（－）RNA化学水解法制备核苷1．核苷生产工艺流程（图14·8）（二）发酵法生产核苷发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多共同特点：①它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯草芽孢杆菌或短小芽抱杆菌为诱变出发菌株；②它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性状上具有特定标记的诱变菌；③它们在发酵培养时必须提供限量的生长因素，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。发酵法生产核苷用于发酵生产各种核苷的菌株有以下共同特点：1．缺失某些酶，造成核苷酸的积累。2．发酵时必须提供限量的生长因子（如腺嘌呤等），使在一定范围内积累大量的核苷。3．磷酸单酯酶的活力很强。生产中多数使用枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌为诱变出发杆菌第二节核酸类药物核酸类药物可分两大类。一类为具有天然结构的核酸类物质，这些品种都是生物体合成的原料，或是蛋白质、脂肪、糖生物合成、降解以及能量代谢的辅酶。缺乏这类物质会使生物体代谢造成障碍，发生病态。提供这一类药物，有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复，促使缺氧组织恢复正常生理机能。第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。第二类核酸类药物大部分由自然结构的核酸类物质进行半合成为结构改造物，近年来发展为化学-酶合成法。大大提高收率，降低成本。一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）（一）结构与性质AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病的新药。AZT的药理作用是人体内经磷酸化后生成了3`-叠氮-2′-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有AZT成份的DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。（二）生产工艺此合成路线的起始原料是胸苷，目前主要是从DNA水解法制备，由于原料来源少，合成路线较复杂，成本很高。已见报道的胸苷合成方法还有两条途径：①从2′-脱氧胞苷或2′-脱氧鸟苷或2＇-脱氧腺苷与胸腺嘧啶反应，经大肠杆菌产生的磷酸化酶催化生成胸苷。②从鸟苷（300mmol／L）与胸腺嘧啶（300mmol／L）反应，在欧文氏菌AJZ992所产生的嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶的催化下生成5′-甲基尿苷，然后经化学法合成胸苷。二、阿糖腺苷Adeninearabinoside（一）结构与性质阿糖腺苷的化学名称为9-β-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷。早在1960年就在实验室合成了阿糖腺苷，1969年美国用StreptomycesantibioticusNRRL3238菌株，1972年